我们可以以植物为例，感受一下基因组编辑工具的转化能力。植物不同于小鼠，并没有胚胎干细胞。即便有，如果不经过一些改良的话，植物细胞中的同源重组率也很低，不足以获得可信的遗传修饰。因此，这些生物体的遗传修补通常是通过随机突变、遗传杂交、农杆菌侵染或者使用一种专门的“基因枪”。
这些技术已经被成功使用，理所当然地，如今大多数作物都经过了遗传改良。但是这些努力都依赖于随机事件，植物学家并没有任何方法进行靶向的基因组修饰，明尼阿波利斯市明尼苏达大学的基因组工程中心主任、遗传学教授Dan Voytas解释道。
现在，得益于基因组工程技术，他们找到了这种方法。“你可以说，好的，我知道那是什么基因，我也知道需要引入到作物中的序列变异，那么你就可以直接将它引入进去，而无需从事大规模的培育计划。” Voytas说。
在研究前沿，这种工具的转化能力毫不逊色。Voytas使用它们去改写如烟草和西红柿等植物的基因组，他也对其他模式物种拥有类似的预期。在临床中，基因组编辑可以与人类诱导性多功能干细胞技术相偶联，例如创建遗传修复的患者特异性移植。
尽管靶向特异性的问题仍然存在，但是麻省理工大学（MIT）科赫综合癌症研究所的学院教授Phillip Sharp将这些技术称为与RNA干扰技术不相上下的“变革者”。“RNA干扰技术对我们进行细胞生物学研究来说是个巨大的转变，此项技术的意义将可以与之相提并论。它将大大加速用我们的生物系统探测从癌症到其他正常发育的问题。这的确是一项很重要的进展。”
基于核酸酶的策略
基因组工程的方法通常是使用一种位点特异性的核酸内切酶，在基因组的特定位点引入双链的DNA缺口，类似于定制的限制性内切酶。当细胞去修复缺口时，它能够不经意地通过加入或去除一些碱基来扰乱这个基因（这一过程被称为非同源性末端连接，或NHEJ），又或是使用一段供体DNA的外源片段来重写缺损的序列，从而利用同源重组来达到研究者的要求。
最早被用于核酸酶技术的一种酶类是巨核酶，但据Cellectis公司的首席科学家Philippe Duchateau解释，这种酶并没有那么好用。这家法国基因工程公司仍在使用这项技术。“它们非常难于操作……（需要）长期昂贵的过程。”
锌指转录因子被证实是更容易操作的。研究人员早就认识到这些蛋白是以模块式结合在DNA上的，每个“指头”都能识别三到四个特异性核苷酸。2003年，两个研究团队独立地展示了，他们能够将特制的锌指矩阵与靶向DNA序列串在一起，并将这一矩阵偶联在FokI核酸酶上，从而在这些位点上诱导特定的DNA变异。其中一个团队敲除了果蝇中的yellow基因；另一个团队则修复了人类细胞中的一个GFP的突变。两年后，Sangamo生物科学公司的研究人员利用这些锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）来修复人类细胞中的白介素2受体gamma基因，展现了该项技术的临床潜力。
然而ZFNs从未真正在学术界中广受欢迎，部分原因是该技术大部分是不公开的——由于Sangamo拥有该技术的知识产权（尽管他们在2007年批准Sigma Aldrich公司用于研究目的的使用），另一部分原因是难以获得优质的ZFNs。理论上来说，Sangamo生物科学公司高级副总裁和首席科学官Philip Gregory解释说，一个由64个锌指（每个对应着一个密码子）组成的文库应该足够靶向任何序列。但是实际上来讲，一个特定的锌指的结合特性在矩阵和矩阵之间是不同的。他说，这是“背景之差”。
2009年，研究人员解析了一种被称为TALEs的新型转录因子。与ZFNs类似，TALEs也是模块化的结构，但是在识别的序列中，每个TALE模块特定了一个核苷酸，并且在进行中或多或少地与它的邻居保持着独立性。通过将定制的TALEs与FokI核酸酶融合（所谓的TALE核酸酶，或TALEN），研究者基本上能够靶向他们想要的任何序列。尽管由于TALENs实际上比ZFNs大很多并且高度重复，克隆的过程本身并不那么琐碎。（Addgene公司和赛默飞世尔科技的一部分——生命科技公司都提供TALEN的研究工具）
TALENs让基因组编辑技术的易使用性达到了前所未有的水平。但是在2012年，这种编辑技术的前景再次令人堪忧，因为霍华德·休斯医学院（HHMI）研究员、加州大学伯克利分校生物化学与分子生物学教授Jennifer Doudna以及当时在Ume??大学的Emmanuelle Charpentier发现了RNA介导的细菌免疫系统复合物，被称为规律成簇的间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）－Cas9复合物。
Addgene公司、Horizon Discovery公司、生命科技公司、新英格兰生物实验室和Sigma Aldrich公司所提供的试剂，双组分的CRISPR-Cas9系统是迄今为止最简单的基因组编辑系统。做TALEN需要至少一周时间，而ZFN有时则需要数月。但是CRISPR-Cas9全部所需的只是一个针对希望靶标的20个核苷酸的“单介导”RNA，以及Cas9核酸酶去切断它。这对于实施该技术的菜鸟来说比较容易，也可以让他们去探索不同的靶向位点。而且，由于它的序列打靶是在RNA而不是蛋白质中进行编码的，Cas9可以一次击中多个位点，这种过程被称作多路复用。
Voytas将基因组编辑的方法比作是DNA测序技术的进化。他说，“ZFNs有点（像）Maxam-Gilbert技术，你能使它运转并从中得到信息，但是操作起来是很痛苦的。TALENs技术（像）桑格测序技术。而下一代测序技术则类似于CRISPR-Cas技术，一切都来得快捷又简便。”他说。
的确，位于英国剑桥的威康信托基金会桑格研究所的资深研究课题组长William Skarnes花费了超过十年的时间，使用传统方式进行小鼠基因敲除实验。构建目标载体，将它们插入胚胎干细胞中，检测基因修饰情况，将细胞插入到胚囊中，然后再进行检测和杂交，上述每个步骤都需要花费6~12个月的时间去创建。现在这一文库看起来已经落伍了。“利用CRISPR技术，只需要简单地将非常简单的试剂直接注入到单细胞胚中，就可以得到同样的突变。这太厉害了——我的意思是，这就是在ES细胞技术开始之初我们的梦想。”
靶向特异性
这并不是说CRISPR-Cas9是毫无缺陷的。至少在它的最初阶段，这一系统的识别力就与使用者想要的有差距，在人类基因组中，已经证实单介导RNA会产生脱靶效应。自然的，研究人员已经找到了多种策略来应对这一问题。
有些人，如来自哈佛大学的遗传学家George Church则证实了，敲除Cas9中两个DNA剪切位点中的一个以产生所谓的缺口酶，然后利用两个紧密间隔的导向RNA将这些分子配对，大幅地提升了特异性。这一策略已经被Sigma Aldrich公司商业化，该公司首席研发科学家Greg Davis指出，该方法可以在分隔超过150个碱基的导向物上起作用。他说，“这是一个关键的区分点”，因为它提供了相当大的靶向灵活性。麻省总医院的病理学研究副主任J. Keith Joung和哈佛大学的David Liu分别独立地描述了另一种方法，将非催化活性的Cas9与FokI相融合。因为FokI必须以二聚体形式存在，这种结构就像配对的缺口酶一样，需要两次结合事件，因此虽然降低了靶向灵活性，但却产生了更高的精确性。
介导RNA的长度也可能会影响特异性。一些研究表明通过将介导RNA延伸两个核苷酸能够降低脱靶效应，而在Joung的手里，截短的介导RNA降低的脱靶突变率能达到5000倍。
Joung说，目前所缺的是点对点的比较，来观察哪个策略确实表现得最好，更不必说用一种方法（除了全基因组测序）来鉴定基因组中的修饰位点了。不过，Church表示该技术具有大约一千亿分之一的碱基对错误率，可能已经足够满足科研应用所需的特异性，而简单的方法如比较多重介导RNA的效应可能会克服潜在的脱靶效应。当然，只有在临床应用中特异性才真的那么重要，他说，而且唯一判别这是否会引发问题的途径是将该技术用到动物实验当中，最终进行人体实验，并观察会发生些什么。
“最终，这不会通过测序脱靶来判定。”他说，“而是通过动物是否患上癌症而决定的。”
临床应用
2014年早些时候，Sangamo公司发表了使用基因组编辑技术的第一例人类临床实验。该公司的科学家从艾滋病毒感染患者中提取了CD4阳性的T细胞，用表达ZFN的病毒去感染它们，以通过NHEJ方法敲除艾滋病毒的共受体CCR5，然后将它们重新放回患者体内。“在每一例中，注入CD4 T细胞后，我们都看到CD4 T细胞在这些患者体内的显著增殖。” Gregory说。而且，相对于非修饰的细胞来说，这些细胞表现出了一种“选择存活的优势”，他说。
Sangamo公司也在追求基于同源重组的治疗法，Gregory说。例如，他们的研究人员最近发表的数据显示了在患有X染色体关联严重组合免疫缺陷症的病人的造血干细胞修复白介素2受体gamma基因的能力，这种细胞群理论上可以用于再次注入病人的骨髓中。
TALENs和CRISPRs也正在步入临床的阶段，Cellectis公司钟情于前者，而Editas医药公司和CRISPR治疗公司则关注后者。
6月，麻省理工大学的Daniel Anderson和Tyler Jacks展示了基于CRISPR-Cas9编辑系统的临床能力。他们通过将一个共表达Cas9和介导RNA的载体，加上包含修复模板的DNA片段，从尾部静脉中注入到一个患有遗传性一型酪氨酸血症的小鼠模型中，该疾病是由编码延胡索酰乙酰乙酸水解酶的基因的一个单点突变造成的。在每二百五十个肝细胞中，注射校正了一个肝细胞的突变，在一个月内改善了患病的表型。“我认为这真是不可思议。”Doudna说。
表观基因组的编辑
由于具有作为核酸酶的所有潜力，Cas9可以做的还有更多。Doudna说，该蛋白就是一种“用打靶的方式识别DNA的分子机器”。因此，就这一点而言，它与TALEs和锌指系统一起可以搭建起更为广泛的基因组修补的平台，可以说是“表观基因组工程”。
研究人员将没有催化活性的Cas9和TALE结构域，与转录激活和抑制子、DNA甲基转移酶以及组蛋白修饰酶相偶联，借此将它们的活性定位于基因组的特定位点上。他们也将TALENs和Cas9与荧光蛋白偶联，来研究染色体结构。Church的团队甚至已经鉴定出满足不同序列需求的Cas9直系同源物，能够在其他用途之外用于同时对不同基因座位的不同活性进行打靶。
这种表观基因组学设计具有潜在的临床价值，哈佛—麻省理工学院博德研究所的核心成员和Editas公司的共同发起人张峰（音译）表示。“从治疗的角度来说，你可能想要激活一个需要表达、但是由于一些表观遗传学因素处于关闭状态的的基因。”他说。例如，在一些遗传疾病中，一个基因的母系（表达）拷贝是突变的，而父系的野生型拷贝却是沉默的。“一个应对方式是通过使用Cas9或者TALEN激活子来激活这个基因。” 张峰说。
但是这种策略也存在自身的复杂性，尤其是考虑到脱靶效应。在一项最新研究中，Sharp和张峰领导的团队使用染色体免疫沉淀技术以及下一代DNA测序技术（ChIP-Seq）去检测，在基因组中催化失活但能由RNA介导的Cas9蛋白的结合位点。该团队在每个检测的介导RNA中鉴定了2000到20000个结合位点。但是当他们使用具有催化活性的Cas9时，在团队检测过的295个潜在的脱靶位点中，仅有一个是真正被修饰的，说明序列结合和切除发生在两个不同的步骤。
“这是一种重要的细微差别。”明尼苏达州罗切斯特市梅奥临床癌症中心生物化学与分子生物学教授Stephen Ekker说，“有很多评论主张，真正发生的是介导RNA在延伸的复合体上找到了双链DNA，就像PCR的引物那样，然后用Cas9来切断它。其实它并不是这样运作的。”Sharp的数据反倒提供了一种结合和剪切属于两个过程的基因组扫描机制，这种观点意味着使用失活的Cas9聚合物的表观遗传控制可能会有意料之外的结果，因为蛋白质可能会结合在位点上而非其目标靶标。“基本上来说，任何真正取决于只有一个特定结合事件的方法都可能遭到破坏。”他说。
然而，并没有因此否认CRISPR-Cas9系统和其他编辑系统的能力。Ekker在教授一门关于基因组工程的课程，他表示分子生物学可能处于新一轮技术浪潮的顶端，类似于由晶体管的发明所带来的技术繁荣。只有时间才能证明新型应用的崛起，他说。但是至少有一点是清晰的：研究者不需要再将基因组视为只能“修修补补”的东西，他们可以对其进行工程操作。■
（译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员）