随着新一代研究者将现代蛋白质组和基因组工具加入到细胞器生物学中时，往往会发现实验方案中的最初几个步骤几乎没有改变。杜恩斯匀浆器、离心机和蔗糖梯度始终在所有细胞学实验室占有重要地位。“自从Claude和Palade的差异离心技术以后，我并不认为该领域发生过任何革命性改变。”位于意大利的威尼斯分子医学研究所科学主管Luca Scorrano说道。
保守派
细胞生物学对于传统技术的依赖让人放心，但也令人恼火。标准方法所使用的仪器和试剂在大多数研究者的实验室中已经齐备，但是要想理解如何才能准确地纯化出一个特定细胞器，却可能极其困难。Scorrano解释说，刚进入该领域的新人会很快发现，现代论文中的研究方法章节，往往参考的是几十年前的工作。“为了找到他们如何分离（细胞器），要花不小的功夫深入挖掘原始文献。”他说。
即便手头掌握了已经发表的实验步骤，实验过程也并不一定会如愿实现。“有一些小技巧通常是研究人员之间口口相传的。”Scorrano说。几年前，他和几位同事将线粒体分离的这种手工实验步骤具体地发表在一本同行评议的期刊上。不幸的是，Scorrano表示几乎没有人能够跟着做出来，因为该领域的大部分技术知识仍旧依赖口头传授。“如果你能（找到）具备（细胞器）制备知识的人，要多加利用。”他接着说。
当研究人员在研究一项细胞器分离的方法时，也应该考虑到他们打算用最终的产物做什么。例如，研究大鼠肝部线粒体在特定时间点的生理状态，可能就需要细胞器的快速粗提，以免它们开始降解。同样的线粒体若要进行蛋白质组分析，则需要更加细致的纯化，而不用过多考虑维持细胞器的生理状态。
Scorrano指出，在线粒体领域，从事蛋白转运的学者（通常研究酵母）和使用大鼠肝细胞进行生物能研究的学者之间，也存在着历史性分隔。酵母线粒体提取通常会用到高渗缓冲液，可能会使大鼠线粒体的生理状态紊乱。
尽管这一技术从一开始就充满了挑战，但Scorrano对预先包装好的细胞器纯化试剂盒并不以为然，他更希望实验室的成员能够掌握整个步骤。“你可能需要一段时间才能轻松地分离得到纯度较好、功能完好的细胞器，但是我的实验室里禁止使用（试剂盒）。”他说。
装备起来
在细胞器分离中经验较少的研究者还是倾向于现成的解决方案，一些公司也在迎合这一市场。“这些绝对是已被广泛接受的实验步骤，没有什么新鲜的事。”位于密苏里州圣路易斯市的西格玛奥德里奇公司蛋白生物学产品经理 George Yeh说。然而，他补充道，“有一点需要关注的是实验室之间的技术一致性” 。使用知名公司制备好的试剂盒和实验步骤能够提高可靠性。“我认为我们所带来的是一致性，你会发现每一批试剂盒看起来都是一样的，并且易于使用。”Yeh说。
西格玛奥德里奇公司目前提供十余种不同的细胞器分离试剂盒，每一种都针对特定的细胞器或某种分析方法进行了优化。“我们的试剂盒能分离过氧化物酶体、高尔基体或内质网，或进行植物研究的叶绿体。” Yeh说。对于那些包含自身DNA的细胞器，例如线粒体和叶绿体，研究者能够采用具有DNA分离步骤的细胞器纯化方法，来进一步研究亚细胞遗传学。
研究细胞器关联蛋白的科学家在纯化目标细胞器后要使用到质谱仪，这就增加了一项新的挑战：以往的一些实验步骤中所用到的试剂可能会干扰质谱仪。为此，西格玛奥德里奇公司推出了一系列能够与质谱仪兼容的试剂与试剂盒。
除了试剂盒之外，化学供应巨头也会单独销售试剂，Yeh承认，现成的试剂盒可能并不总是最合算的选择。“如果你要做一百多次的实验，我打赌你自己配试剂盒会更好。”他接着说，“我们（的试剂盒）所服务的对象是只想做一两次的人。”
无论他们选择哪种方法，Yeh也附和Scorrano的观点：任何实验室一旦下了功夫去学习和实践那些步骤，都能有效地开展细胞器的提取。“最初总会有些困难需要逾越，但是他们总归会上道的。”Yeh说。
精明的买手
多年以来，一些研究者和实验室供应商也已经开发了自己独特的小技巧，去改进细胞器的分离步骤。尽管大部分修改是微不足道的，但加起来却形成了某些分析的类型。“传统方法所提供的纯化蛋白能达到进行免疫印迹的程度，即使降解的蛋白可能也是可行的……但是当你要做活性分析时，就需要蛋白保持它的功能状态了。”位于加州的Milpitas公司分析试剂盒产品经理Payal Khandelwal说，“在这方面有更多强化技术涌现出来。”Khandelwal接着说。
除了蛋白质降解以外，过去的技术也可能会无法有效地将不同的细胞器从细胞质组分中分开。这对于生理实验可能不是问题，但是在高灵敏度的基因组或蛋白质组研究中，这些污染可能会掩盖住研究者试图捕获的现象。
Biovision是其中一家试图解决该问题的公司，他们细致地优化了细胞器纯化试剂盒。“无需引入任何额外的机器或设备，它只需要随着试剂盒提供一些非常特异和先进的试剂。” Khandelwal说。除了试剂盒，研究者只需要普通的离心机和他们手头可能已有的相关仪器。
或许，使用这些试剂盒时最具挑战的部分是判断哪一个是最好用的。一种方法是通过比较实验步骤，看哪一个是最好用的，但是各个公司不会公布他们的缓冲液中的专利成分，因此，很难预测哪种试剂盒最适合某个特定实验室的需求。Khandelwal建议，要询问一个试剂盒的预期产量，以及判断分离是否成功所需的检测。“如果客户感兴趣的假设是线粒体DNA，毫无疑问就需要把DNA分离出来，但是你怎么能知道它是否是纯正的线粒体DNA，或是已经被核DNA所污染了？”Khandelwal质疑道。
使用为特定实验类型所优化的试剂盒的另一项好处就是它所提供的技术支持。如果实验没有成功，使用试剂盒的研究者可以致电制造商帮助他解决问题，而自己配试剂的研究人员则只能依靠自己解决问题。
大于各部分之和
尽管生化学家可能急于从他们的细胞环境中分离细胞器，但通常也应当首先仔细看看整个系统。这对于线粒体来说尤其如此，因为可能会由于细胞生理状态的差异而采取不同的配置。“我们起初将线粒体描述为一个小足球状的细胞器。”位于英国剑桥Abcam公司的总经理James Murray介绍。他补充道，“我们开始意识到实际上并非如此，它们不一定是分离的细胞器。”
的确，线粒体可能是独立的椭球体或可能会形成连接其它结构（例如内质网和质膜）的网状网络，这取决于细胞的类型及其当前状态。“这是一种非常动态和易变的情况。” Murray表示。
这就给想要研究分离线粒体的学者带来了阻碍。比起分离分散的细胞器来说，将一个意大利面一样的薄膜网络拽出细胞是相当困难的。Murray建议，研究者在决定如何去打开它之前，首先应该通过使用诸如免疫荧光之类的技术来观察细胞的构成。如果问题在于是否某个特定的蛋白定位于某个特定的细胞器上，显微镜检查就可以提供所有所需的数据，不需要研究者采用任何分离技术。
对于确实需要分解细胞的人而言，Murray重申了其他专家对为最终分析选择适合的实验方案的建议。需要完整、具有生理活性的线粒体的实验是最难完成的细胞器分离实验之一。最初要使用健康、新鲜的细胞，实验人员需要以最快的速度完成整个实验流程和分析。如果把线粒体保存于冰箱之中，之后想要复苏线粒体，往往都会失败。
获得活性线粒体同时也需要蔗糖梯度离心，目前试剂盒制作商还无法简化该步骤。研究者必须将两种浓度的蔗糖混合起来，缓慢地将混合物注入离心管中，产生由离心管底部到顶部稳步增加的密度梯度。该梯度必须在使用前即刻配制，而且要想得到一致的结果也需要多加练习。
Abcam和其它公司正在开发基于抗体的细胞器纯化方式，可以省略冗长的蔗糖梯度，但是这些产品仍在研发过程中。“我认为可能我们正站在往前迈进一大步的顶端，采用基于亲和的方法来分离细胞器。” Murray说。
甲基化实验室
对于只想提取线粒体或叶绿体DNA、但并不关心细胞器生理状态的研究者来说，他们的春天已经到来了。位于马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室（NEB）的科学家已经研发出一种基于抗体的实验方法，用于分离细胞器和核DNA。该技术利用了两种遗传材料库之间甲基化的差异。
“实际上细胞器的DNA是不被甲基化的，或者非常低程度的甲基化。” NEB应用和产品研发科学家Erbay Yigit解释道。Yigit和他的同事创造了一种与抗体恒定区融合的甲基结合蛋白，从而仅能结合被相对充分甲基化的DNA。通过用工程化的蛋白去结合提取的细胞总DNA，该团队能够从线粒体或叶绿体DNA中沉淀出核DNA。
研究人员最初研发出从人类基因组DNA中分离微生物的方法，用于微生物基因组研究。但是他们很快发现，该方法对于细胞器DNA的分离也同样有效。NEB目前以试剂盒的形式销售这些试剂，包括包覆在蛋白A上的磁珠，能够通过结合抗体恒定区来沉淀甲基化的核DNA，无需离心的步骤。“该方法非常简洁，因此你可以从提取的DNA开始，不用担心任何事情。”Yigit说。在完成标准的DNA纯化步骤之后，研究者还需要额外几步去分离细胞器和核DNA部分。
然而，植物生物学家可能仍然需要去解决棘手的分离问题。Yigit解释说，NEB试剂盒将线粒体和叶绿体DNA留在同一个部分。“来源于这些细胞器的DNA非常相似。”他说。
下载应用
尽管不断增加的试剂盒确实加速了多种类型的实验，一些科学家或许甚至不用动手做实验，就能在亚细胞研究中领先一步。“如果你知道蛋白质序列，你就能在某些情况下非常准确地推断蛋白质的位置。”加拿大不列颠哥伦比亚省本拿比市西蒙弗雷泽大学计算科学院教授Fiona Brinkman说。
Brinkman与她的同事已经开发了一种称为“PSORT”的软件来进行此类预测。该团队一开始就聚焦在细菌和古菌蛋白质，但是该程序的一个分支也能够用在真核细胞上。“我们（越来越）感谢（细菌）具有与细胞器类似的结构。”Brinkman说。
PSORT使用了一种机器学习的算法，用经过实证的蛋白定位作为例子，随后据此推算来预测哪些其他蛋白在细胞中的定位会与之类似。Brinkman解释道，“在得到更多实验室数据的方面有很大的动力”，来进一步对算法进行训练，但是对这些数据的搜索已经揭示了一些分离细胞过程中意想不到的困难。Brinkman强调，研究人员需要分析所有他们分离的部分，而不是仅仅分析最感兴趣的。“你可能会有来自其他部分的污染，因此你需要看到（一个蛋白）实际上主要位于一个部分中。”她说。
然而，在获得经过细致审查的数据之后，PSORT已经成长为一个非常强大的工具。“目前，对于传统上得到深入研究的生物体来说，它表现出惊人般的准确。”Brinkman说。她接着说，她的团队目前正在拓展该程序，让其可预测更加广泛的生物体。自从开发成功以来，PSORT已被下载了成千上万次，并在许多发表文章中被引用。
PSORT的普及意味着许多并没有得到生物信息训练的研究者也能使用它。Brinkman也鼓励这种情况，但是她提醒用户要去阅读相关的发表文献。“对于任何计算机方法而言……你需要明确自己已经认识到其准确性，以及如何利用某种特定方法进行研究。”她说。该建议也响应了Scorrano所说的传统差异离心法：“很简单。（但是）要想解读（结果）却更为复杂。”■
（译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员）
Alan Dove是马萨诸塞州的科学作家和编辑。
DOI: 10.1126/science.opms.p1500100
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2015年12月4日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/custom-publishing/technology-features/organelle-recitals。