位于华盛顿特区的乔治·华盛顿大学化学教授Akos Vertes使用质谱技术在单细胞水平上量化代谢物。他对该工作的正当理由是：“细胞群体是杂合的，而大群体中单个细胞之间的这些差异有时变得非常重要。”
例如癌症干细胞，或是药物耐受的细菌，又或是大脑中有着很多微小差异的神经细胞类型。通过总体分析可能会检测出这些亚群，但也不容易：它们的信号可能会被主要群体所掩盖。并且在任何情况下，这种分析会模糊细胞间的区别，很难弄清哪些细胞为群体做出了哪些贡献。理清这一系列竞争性信号的唯一方法就是进行单个细胞的检测。
其他研究者转向单细胞的方法的原因，是因为他们别无选择。例如在微生物学中，绝大多数微生物无法在实验室内培养，位于缅因州东布斯贝的毕格罗实验室单细胞基因组中心主任Ramunas Stepanauskas说。“对于它们我们确实知之甚少，尽管它们是全球生物地球化学循环的主力军；它们栖息在任何你能想到的环境中，包括我们自己的身体，而且它们是天然新产品、生物能源和其他应用领域的大量的未开发资源。”他说，开发这些微生物能力的最佳方式是对其中每个进行单独测序，让它们的遗传材料告诉研究者培养皿无法获知的信息。
从根本上来说，单细胞研究的过程一点也不困难。简单分离一株单细胞，裂解，收集它的分子内部结构，然后分析你所得到的东西。当然，在实践中远没有这么简单明了。
“在单细胞分析中存在各种各样的陷阱。”宾夕法尼亚大学医学院单细胞生物学宾州项目联合主任 Jim Eberwine说，他从2012年起在冷泉港实验室讲授一门单细胞分析技术的课程，并从20世纪90年代起就开始在自己的实验室研究单细胞基因表达。据Eberwine介绍，无论研究者的兴趣在于细胞中的DNA、RNA、蛋白或者代谢物，根本的问题都一样：“怎样从噪音中检测到你的信号。”研究人员设计出一系列巧妙的策略去应对这一问题。
单细胞的扩增
单细胞生物的关键无疑是分离一个单细胞。通常是通过使用显微操作、微流控，或者是Stepanauskas钟爱的荧光激活细胞分选法（FACS）。
另一种方法是由北卡罗来纳大学教堂山分校和北卡罗来纳州立大学联合生物医学工程系主任Nancy Allbritton实验室所研发的microraft 阵列（Microraft array，MRA）。
MRA是一种微小透明、有磁性的、聚苯乙烯元素构成的阵列，每个都小到可以装进平板或者载玻片上的小孔。MRA已被Cell Microsystems公司商业化，通常包含大约一万个小孔，Allbritton说，尽管有些是以百万级为单位。研究者将细胞平铺，让每个元素平均占有零个或一个细胞。他们随后可以立即成像矩阵，或者让细胞生长并产生复杂的表现型。使用显微针刺穿矩阵的底部并且释放MRA元素，以温和地分离目标细胞。由于这些元素是具有磁性的，因此易被捕获，随后它们可以用于分析或克隆扩增。
据Allbritton介绍，该系统具有其他系统无法企及的分离策略，例如基于毒性T淋巴细胞杀死靶细胞的能力进行分离。在其中一项研究中，北卡罗来纳大学教堂山分校Scott Magness与Allbritton开展合作研究，使用MRA去研究肠道干细胞。其中，该团队使用这一平台来探究，肠道干细胞是否必须与其他细胞产生物理联系，以达到其全部潜力。“他非常明确地展示出，它们确实需要接触到潘氏细胞以完成生长、繁盛和分裂，并达到最高的生长率。”Allbritton说。
Vertes使用了一种低通量的方法开展代谢组学研究。他的团队通过使用尖锐的毛细管和显微操纵器（通常用于膜片钳和胚胎操作的工具），从贴在培养皿底部的贴壁细胞中抽取了一皮升材料的一小部分，随后将其直接注射进质谱仪中。
通过这种方式，Vertes说，他的团队可以在约30种培养的肝细胞中，每种定量约22种代谢物和54种脂质——当然，这并不是全部的代谢组，但是已足以揭示诸如细胞的腺苷酸能荷（测量细胞健康的指标）等问题。Vertes指出，在群体水平上检测这种变异一直是可行的。但是如果是在单细胞水平上，他就能观察到能量状态的分布，并且将这些值与形态学、代谢活性等参数相对应。“对于每个细胞而言，我们都能判断它是否是健康细胞、半死的细胞或者进入程序性死亡的细胞。”他说。
单细胞转录组学
伊利诺伊大学香槟分校James R. Eiszner家族资助的化学系主任Jonathan Sweedler，研发了细胞分离和分析的另一种全新方法。他的团队将大约1万个细胞分散在显微镜载玻片上。接着他们对这些细胞进行核染色，使用荧光显微镜进行定位，随后将这些坐标通过激光进行质谱分析。由于细胞是分散分布的，因此激光器击中了哪个细胞从来不是问题，这在传统的质谱成像中也经常发生。“如果需要，我们确实能在一下午的时间以这种方式完成十万个细胞的分析。”
Sweedler的方法因此牺牲了细胞环境和相互作用获得了通量。他能够定量更多的离散细胞，但同时他也失去了这些细胞在何处和其他细胞产生联系等信息。这也是单细胞方法所共有的问题，Eberwine说，因为它也在潜在地改变着细胞生物学。“你将细胞从它们的天然微环境中剥离出来，而这正是它们进行细胞间连接和细胞环境影响的场所。”
的确，通过使用一种被称为“体内转录组分析（TIVA）”的方法，Eberwine和他的同事比较了完整小鼠脑部切片和离散细胞中的锥体神经元的基因表达模式。他们发现，完整组织中的神经元平均表达12000个转录本，离散时这一数字为16000个。这一发现暗示，细胞表达基因的能力受到相邻细胞的物理信号的调控。局部微环境“对于基因表达而言就像刹车”，Eberwine说。
TIVA采用了一种偶联在细胞穿透肽和生物素基团的光激活双链寡核苷酸。当这一“TIVA标签”穿过细胞膜，肽段被去除，分子被锁死在细胞中。随后，激光照射将双链分离（“解笼”），揭示了一种用于捕获目标细胞中多聚腺苷酸信使RNA（mRNAs）的序列。最终，生物素标记的RNA-RNA杂合体被链霉亲和素磁珠所分离、扩增，并且使用RNA测序的方式进行分析，让团队能够从特定细胞到亚细胞区域的范围内进行基因表达定量分析。“我们能够在细胞体中激活它，能够在树突或细胞核中激活它，也能在一个或多个细胞中使用它。” Eberwine说
在哈佛大学，霍华德·休斯医学研究所研究员、David B. Arnold 科学教授庄小威发明了随机光学重建显微镜超分辨方法（STORM），她同时也研发出一种原位单细胞转录组分析的方法。但是不同于TIVA，她这项基于成像的方法将信息精确地保留在细胞的转录位置。“我们知道RNA在细胞内的分布并不一致。”庄小威解释道，“RNA的局部分布实际上对于局部细胞结构的构建和维系尤为重要。”
这项多重抗误差荧光原位杂交技术（Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization）是一种基于原位杂交的方法，用于同时量化成千上万个转录本。在一个具体执行过程中，每个转录本被配以一种独特的二进制编码。窍门在于一点点读取代码。
为此，互补到每个转录本上的寡核苷酸被对应着不同比特的读取序列所分隔。可能含有十万个或更多寡核苷酸的混合物与固定细胞中的mRNA进行杂交，“将每个胞内RNA转变成读取序列的组合”， 庄小威解释道。随后使用与读取序列互补的寡核苷酸，对细胞进行逐个分析。每轮杂交结束后，细胞被成像，荧光探针淬灭，然后这一过程重复进行。在任意一轮中，每个荧光信号都代表一个RNA，其编码在该位置根据相应的二进制编码被读为“1”。通过比对16轮杂交和淬灭产生的点，这一系统能够定量细胞中大量的RNA，并找到它们的亚细胞定位。
不过，据庄小威介绍，多重化还只是故事的一半。FISH具有很低的但可检测到的错误率，庄小威说。经过了16轮的杂交，它们会累加起来。因此，按照电信学的经验，她的团队设计了自己的编码，每个码与其他任意一种的差别多达4比特。“这意味着，你要在一个RNA中犯四次错误才能将它转变为不同的RNA。”她解释道。因此，即使某个转录本被读出有一个错误，软件也能确定其正确的身份。不过包含2个或更多错误的RNA也能被检测到，但却不会被更正，因为已经无法明确的进行鉴定。“实际上我们能够同时进行错误检测和更正。” 庄小威说，“这就是我们怎样得到高度精确的测定结果。”
通过使用这一策略，庄小威的团队在单个细胞中定量了多达1千个转录本。但是没什么原因可以阻止这一数字变得更高，她接着说。例如，32位代码可以轻松编码3万个基因。目前，她希望将该技术应用于在人类大脑和癌症中绘制不同的细胞类型，以及其中的RNA的亚细胞分布。
单细胞蛋白质组学
瑞士苏黎世大学定量生物学助理教授Bernd Bodenmiller和美国斯坦福大学医学院病理学与免疫学助理教授Sean Bendall以前都是Garry Nolan在斯坦福的博士后。Nolan为质谱流式细胞技术的研发做出了贡献，该技术介于流式细胞法和质谱法之间，能够克服此前技术中的一个关键缺陷。
传统的流式细胞仪受限于交叠的荧光通道，限制在约18种同步信号或者标记。然而在实践中，实际的限制更低。质谱流式细胞技术理论上可以处理超过100个通道，但是目前限制于大约44个，原因是与之配合的化学需要跟上仪器发展的脚步。
类似于流式细胞仪，由DVS科学公司（近期被Fluidigm公司收购）所商业化的质谱流式细胞仪——CyTOF系统是一种基于流式的方法，使用重金属交联的抗体而不是荧光染料来获得更高的信息量。然而在两篇发表于2014年的论文中，Bodenmiller和Bendall同时展示了一种方法，将CyTOF分析仪转变成了质谱成像仪，能够进行一种高通量的单细胞蛋白质组空间分析。“我们打造了你可以称为基于质谱流式细胞技术的显微镜。” Bodenmiller解释道，能够开展“空间系统生物学或空间蛋白质组学”的研究。
与先进的质谱成像系统一样，该方法可使研究者在原位对逐个细胞的蛋白质含量进行检测。但是，与传统的质谱成像通常检测丰度最高的蛋白不同，质谱流式仪让研究者可以真正地预选他们想要成像的蛋白。
Bodenmiller使用他的质谱流式显微镜来研究肿瘤微环境对新陈代谢的影响，例如巨噬细胞浸润的影响。“我认为我们的成像质谱流式方法达到了最佳均衡点，因为它是基于抗体的，因此我们能够通过利用背景知识来检测不同的免疫或基质细胞，而且我们也能用多种抗体去获知这些细胞的真正功能。”Bendall和Nolan使用它们的多路复用离子束成像系统去探究乳腺癌切片的组织结构。
Bendall和Nolan分别使用传统的CyTOF质谱流式仪，绘制B细胞发育过程中的单细胞轨迹，使用一组42个标记的分子谱——包括了所有与B细胞发育关联的胞外标记到胞间信号因子，并使用被称为“Wanderlust”的全新算法来追踪淋巴干细胞分化为成熟B细胞时的分子特征转变。
尽管40余种参数使人印象深刻，像Bendall和Bodenmiller这样的研究者希望最终能将这个数字推得更高。这一切都需要有效的化学方法将离子与抗体关联。Bendall笑着讲述了流式和质谱流式细胞仪中的一个长期发展过程——“PDS”或是“参数依赖症”。“起初你会问自己，‘额，我要40种参数到底要干什么？’随着你进行了一段时间以后，你会说，‘我将如何将所想测量的一切都整合进40个参数中？’”换言之，研究者永远不会对更多的数据说不。
当然，这些数据只反映了单细胞生物学的一个具体方面。该领域的首要挑战依然存在，Eberwine说，现在所需的是一种整合这些不同数据集的方法，来获得对细胞的定量的、可重复的、全方位观点。对这一问题的推动仍在持续。“我相信所获得的信息将非常惊人。”他说。■
（译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员）