免疫组化技术关乎的都是空间关系。如果研究人员想要知道一段给定组织是否表达一种特定的蛋白质，他们可以使用质谱或免疫印迹。但是为了确定在组织的哪个位置发现了这种蛋白，他们必须在细胞层面对其进行可视化。
这时，IHC就派上了用场。该方法利用抗体作为特异性抗原的探针，生成组织超薄切片的图像（例如肿瘤活检），通过染色来显示一种或多种蛋白的表达和空间分布。
“它回答的是定位的根本问题，是你在哪里会找到一个特定的靶抗原。”MilliporeSigma公司（位于德国达姆施塔特的默克集团的生命科学公司）技术和科学内容开发团队高级经理Kevin Long说。
例如，研究人员可以使用这些空间数据来跟踪疾病部位的淋巴细胞浸润；临床医师可以使用该数据对肿瘤进行分级，或评估患者对某种疗法可能作出的反应。
圣迭戈海军医疗中心（NMCSD）的IHC实验室每年会接触到大约18000例手术病例，根据其主管Greg Gates介绍。每例会产生2~100多个不等的切片，这取决于样品的大小和病例的复杂性。但平均而言，Gates说，每一例约产生4张切片，这样总共会有72000张切片。大多数病理切片并不需要IHC；据安捷伦科技公司IHC营销总监Andreas Hoel估计，大约80％的病例可以由组织学染色（如苏木精和伊红）单独确诊。但剩下的部分则需要更全面的评估。
IHC的处理过程需要4~8小时，繁琐但并不复杂；起始于显微镜载玻片中的组织，总体流程包括抗原修复、初级和二级抗体的孵育、洗脱，并与显色剂反应。该数据随后使用光学显微镜进行解析。
“我认为描述IHC的最好方式是，它太容易了，高中生都可以去做。”美国国立卫生研究院实验病理学实验室主任、《组织化学与细胞化学期刊》（JHC）主编Stephen Hewitt说。
问题是，在这些步骤里，每个步骤可以进行调整，并没有一个“标准的”IHC实验步骤。正如在生物学的许多领域中，研究人员并不总是能够对自己的方法进行足够详细的记录，以供其他人进行重复。而且无论如何，所获得的图像往往是用双眼读出的，这种方法有其内在的主观性。这导致每天在不同实验室的变异性非常大。但是，研究人员也已经开发出降低变异性的方法，同时提升IHC的其它痛点。
自动化样品制备
降低IHC变异性的一种方法是采用自动化，采用的系统将精确一致地处理每张切片，同时，也让技术人员和病理学家可以腾出时间处理其他任务。“我们所探讨的两大支柱的改进，是实验室效率和诊断准确性。”Hoel说，例如，他们的Dako Omnis系统可同时自动化进行IHC和荧光原位杂交（FISH）的染色过程。
NMCSD的病理实验室已经购置了IHC流程两个步骤的自动化系统，Gates说：来自Polaris和徕卡公司的样品处理系统对固定样品进行脱水和补水处理，而来自罗氏公司的BenchMark Ventana系统则会自动进行IHC染色。
对于相对较轻松的工作负荷（每周约100次分析），来自MilliporeSigma公司的SNAP i.d. 2.0 IHC系统提供一种真空装置，提高手动切片染色的效率和可重复性，Long表示。通过真空一次性吸除所有切片上的试剂，研究者能够同时处理多达24个切片，他说。
Hewitt说，自动化为临床实验室提供了无可争议的优势。但他也指出，多数从事基础研究的学者对这种功能的需求较少。毕竟，自动化仅仅是机器人的另一种说法，他解释说。“如果你只是一名研究人员，需要为研究做几个实验，要么找一位优秀的合作者，要么就手工完成。”
数字病理学
IHC的另一个转型发展是所谓的数字病理学的出现。不同于在显微镜下观察和分析IHC切片，数字病理学系统完整地扫描染色切片，并将产生的全切片图像以数字形式存储，随后可以在电脑上进行观察和操作。
该方法有诸多好处，徕卡病理公司图像分析和病理影像高级产品经理Catherine Conway说，该公司以Aperio的品牌销售基于亮视野和荧光的切片扫描仪。一方面，全切片成像使医学教育更加便利，确保学生能够接触到有趣和罕见的病例，这些可能是在共享物理切片时无法看到的。而且，它也简化了远程与同事分享数据并获得补充性意见的过程——这个过程也被称为“远程病理学”。
例如，匹兹堡大学医学中心（UPMC）提供了一个门户网站，研究人员可以远距离上传切片，由医院的病理学家进行分析，每张切片的收费在50~150美元之间。UPMC的肝脏及移植病理学Starzl教授Anthony Demetris在 2012年共同发表了一项记录该校远程病理学经验的研究，他表示自己评估的样品来源甚至来自于澳大利亚和亚洲。“这使得互动比之前的其它方式要顺畅得多。”
其中一例，Demetris远程评估了一位老年患者的肝部活检，最初的主治医生怀疑这只是简单的炎症。Demetris 的数据分析显示它是一个肿瘤，因此他请在线的临床医生进行T和B淋巴细胞以及EB病毒核酸的后续染色，并将结果上传。短短几天内，他说，就获得了恰当的诊断：EBV相关淋巴瘤。
全切片成像还可以为每张切片提供方便使用的记录（与物理切片截然相反），从而简化了样品的存储和检索，而且它还有利于进行数据分析和后期的再分析。“你可以一次又一次地回去看同一张图像，并提出不同的问题。”Demetris说，“它实际上成为一个可重复使用的数据资源。”
除了徕卡以外，滨松、奥林巴斯、飞利浦、罗氏和蔡司等其它公司也都能提供切片扫描仪，但由于每个系统使用专利所有的图像格式，研究人员对于图像的操作一般会受限，特别是如果他们的扫描仪是来自多个供应商。
位于美国宾夕法尼亚州匹兹堡市的卡内基·梅隆大学计算机科学的卡内基教授Mahadev Satyanarayanan(“Satya”)已经获得了处理这一问题的一手经验。几年前，Satya与病理学家合作，将他开发的一种图像搜索算法移植到数字切片的图像分析中。他很快就碰壁了——根本无法在不同的图像格式下进行搜索。“唯一能解析这些格式的软件是专利软件。”他说。
因此，Satya的团队找出了不同文件格式的细节，将这些知识编进了一个开源C语言库OpenSlide中。他解释说， OpenSlide的功能就像一台计算机的打印机驱动程序，让程序员无需知道既定扫描仪的工作原理。“你只需说‘打印’，下面的设备驱动程序应该就会为那台打印机的具体特质提供适当的翻译。”同样，使用OpenSlide的程序员可以简单地指导软件对文件进行读取，无需知道它究竟是如何被构建起来的。
研究人员也使用OpenSlide去构建其它应用，如远程病理学门户网站和一个名为“SlideTutor”的教育资源。对于Satya来说，他已经用其来实现自己的搜索工具，称为“钻石”，病理学家们可以用它咨询问题，如：“在这个日期和那个日期之间，这家医院接待的所有服用过这种药的患者中，你有没有看到哪个（患者）与我在切片中看到的以下特性类似？”他说，OpenSlide“大大提升了你作为设计师的自由度”。
图像分析
数字病理学的另一个优点是执行复杂图像分析的能力。拿一张全切片图像，这些软件包就能鉴别出细胞和亚细胞的划分（通常是细胞质、细胞核和细胞膜），输出的值包括细胞计数和染色强度。
例如，来自Indica实验室的Halo软件包，包括的模块有用于计算在细胞核或细胞质中表达一种或两种蛋白的细胞，用于计算膜染色阳性的细胞，用于原位杂交评估等等。研究人员甚至可以评估空间关系，Indica的首席科学官Kate Lillard表示。“举例来说，在距离最近的肿瘤细胞50、100或200微米内，有多少CD8阳性的淋巴细胞？”在最近的一项研究中，由加州大学洛杉矶分校Antoni Ribas带领的一支研究小组使用Halo来量化骨髓瘤不同组织区块中的淋巴细胞亚型。他们找到了一种正相关性——特别是存在于肿瘤边缘的CD8+细胞的出现，与靶向“程序性死亡-1”受体的抗体的患者反应之间——这些数据表明，如果选择最可能从其中受益的患者，可能可以增加这种疗法的效力。
当然，图像分析也不是件新鲜事，Lillard说——用于分析显微照片的软件已面世多年。 “这里最大的区别是，我们致力于对GB级大小的图像的处理。”因此，该软件必须经过特殊的优化，能够从计算机的硬件中占取尽可能多的能力。例如，在一项50张全切片图像的分析中，Halo总处理时间的范围可以从单核CPU的21.7小时到只有0.9小时（64核）不等。
许多公司销售这些工具，包括Definiens公司（最近被MedImmune公司收购）、PerkinElmer公司和Visiopharm公司。另外，哈佛大学和麻省理工学院博德研究所的Anne Carpenter研发了CellProfiler和CellProfiler分析软件，这是一对能够完成许多相同任务的开源软件包。
理论上来讲，这样的工具可以使临床工作更加轻松，例如，可以快速标记和计算细胞与感兴趣的区域。然而，Lillard说，图像分析工具主要是用于研究和药物开发，而不是临床实验室，这主要是由监管壁垒所导致的。但是她说，这也可能会有所改变。目前，研究人员正在使用Halo和相关软件，来鉴定与药物反应或存活相关的有趣的生物标志物。但要想使其有效，他们将不得不将这些发现从实验室转化至临床。“希望这些能最终转化到临床上。”
量化免疫荧光
多亏了数字病理学和图像分析软件，病理学家可以由目前采用的相对粗分的染色强度梯度（0，1 +，2 +，3+）转换为连续变量的梯度（如，0~1000）——这种变化可以让研究人员找到更微妙的生物标志物。
然而，根据耶鲁大学病理学教授、耶鲁病理组织服务机构主任David Rimm表示， IHC的传统方法不能与连续变量真正兼容，因此并不是真正意义上的量化。他说，IHC“不是线性的，也不可重复”。
他解释说，在传统的IHC中，交联了辣根过氧化物酶的二抗将显色底物转换成深褐色或红色沉淀。但由于光线不能轻易透过这种材料（Rimm称之为“泥”），该方法充其量是半定量的。
Rimm的替代方法是使用荧光底物，这是一种称为“量化免疫荧光”（QIF）的策略。在该策略下，蛋白丰度的微小变化会导致光输出产生相应的改变，再加上全切片扫描和数字图像分析，该技术能够为IHC分析提供一个强大的平台。
例如，乳腺癌组织活检通常是检测人类表皮生长因子受体2（HER2）的表达，以确定HER2—靶向的药物赫赛汀是否可能有效。赫赛汀与蛋白的胞外域结合，但大多数在临床用于HER2 IHC的抗体靶向的是蛋白的胞内结构域，Rimm指出。
在2014和2015年，Rimm和他的团队用QIF来评估他们是否能检测靶向HER2胞内／胞外结构域的抗体的染色差别。事实证明，他们可以做到。其他小组使用显色底物3,3'—二氨基联苯胺和IHC，并没有发现使用胞质域抗体和胞外域抗体的患者之间的可观测差别——两种抗体的染色强度是一致的。但在QIF中，差别就开始显现出来。“约10％~20％患者的HER2蛋白没有任何胞外域。”他说，“因此他们不太可能受益于曲妥珠单抗（赫赛汀）。”
这种看似微小的波动可能会导致一种药物的成功或失败，Rimm说。谈及目前使用的染色类型，他说，“科学不是一个序数，而是连续的”。可能在强度的色调更加精细后，许多潜在生物标志物的价值才会显现出来。
“谁会知道外面有多少其它的标志物，它们最终的失败就是因为没有对它们进行定量测量所必需的可接受的方法，而你需要在该药物有效之前就达到一定的水平？”Rimm问道。
这并不是说每一个组织病理学家都需要切换到QIF和数字扫描。“大多数病理学家有意为IHC所做的，都是非定量的。”Rimm说, “这是‘符合目标的’。”的确，IHC已经符合目标地被使用超过70年了，仍旧看不到明显的结束信号。■
（译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员）
Jeffrey M. Perkel是爱达华州波卡特洛市的自由科学作家。
DOI: 10.1126/science.opms.p1600103
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2016年3月3日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/custom-publishing/technology-features/immunohistochemistry-21st-century。