蛋白质组学似乎是吸引细胞信号传导研究者的一门自然科学。毕竟，当前研究的大多数信号分子都是蛋白质。但是很多细胞信号传导的研究者却逐渐发现，蛋白质组比基因组等呈现出更大的复杂性。“蛋白质本身就很复杂，常常只在某种特定的条件下才能发挥作用，这使得多重和平行分析变得困难重重。”LC Sciences公司商业发展副总裁 Chris Hebel说。不仅如此，这些复杂分子间还存在多种相互作用，而且你会有大量的问题要问和堆积如山的数据要去采集。蛋白质以转录后修饰（PTMs）的形式（如磷酸化、乙酰化、十四烷酰化、糖基化等等）所发生的变化，将更进一步改变其功能，结合伴侣，以及信号特性，甚至可能引发细胞中其他生化变化的级联反应。
质谱揭示信号通路
细胞信号传导研究近来得益于一系列富集方法和质谱技术发展的结合。一个最好的例子是“用于选择性富集PTMs的亲和方法” ，哈佛大学和麻省理工学院的布罗德研究所蛋白质组平台负责人Steven Carr表示。例如，近期改良的金属亲和富集法就帮助优化了丝氨酸/苏氨酸以及酪氨酸磷酸化的样品检测。当研究者使用这些预先富集的样品作为液相色谱—质谱联用（LC/MS）的起始样品时，他们就“能够更加深入到样品中去”， Carr说，“如今鉴定出两到三万个磷酸化位点已经十分普遍，技术的确已经相当深入了。”
Carr实验室目前主要使用的质谱技术来源于赛默飞世尔科技公司的Q Exactive系统。“之前用的是Orbitraps系统，但现在我们更多地集中于使用Q Exactive Plus 和 Q Exactive HF仪器，因为每个反应点的价格非常低。我们的高通量实验室有很多并行的项目，因此拥有很多高性能仪器十分必要。”Carr表示。市场上的其他供应商也提供高性能质谱系统，包括爱博才思公司和沃特世公司。
“这些新一代的混合仪器极其灵敏，同时在质量精度和分辨率上也保持了非常高的性能——现在我们已经认为这是理所当然的了。”Carr表示。八到十年前，研究人员必须要付出一些代价。“要么你为了性能因素就得放弃灵敏度，或者你保持灵敏度却要放弃质量精度和高分辨率。如今，你再也无须做出这些妥协。”
并且质谱系统也在继续改良。“并不是所有的仪器都在前端配备了所谓的离子漏斗。”Carr说。离子漏斗是可以使质谱系统更加灵敏的装置。沃特世、安捷伦科技公司和赛默飞世尔科技为特定的质谱系统提供离子漏斗。“另一个将要发生改变的是在质谱系统中离子移动性的更广泛的应用。”Carr表示。离子移动性能在气态中帮助多肽和蛋白相互分离，从而降低样品的复杂性，Carr将其比作是气相色谱。“这样也改善了灵敏性，同时可以提高速度。”他说。
质谱系统的新进展还包括赛默飞世尔科技的Orbitrap Fusion系统上的ETD选项。ETD即电子传递解离（electron transfer dissociation），它的价值在于它是以“一种碎片化的形式让你将PTMs定位到蛋白骨架上。” 赛默飞世尔科技公司生命科学质谱的组学市场部主任Andreas Huhmer表示。赛默飞世尔也提供用于取出蛋白激酶的激酶探针。赛默飞世尔科技公司的Pierce激酶富集试剂盒使用ActivX的ATP或ADP探针去标记激酶的活性腺苷三磷酸酶位点。该探针包含一个脱硫生物素标签，能够富集标记过的激酶。
国家心肺和血液研究所（NHLBI，美国国立卫生研究院的一部分）上皮系统生物学实验室的高级研究员Mark Knepper，也在利用近期质谱的新进展来研究磷酸化蛋白质组。“质谱方面的研发进展能在更高的质量分辨率下收集更多的光谱。”他说，“这也促使了灵敏性的显著提高。”
Knepper的实验室通过鉴定特殊的蛋白激酶和磷酸酶来构建信号网络模型。该科研团队使用CRISPR-Cas9基因组编辑系统，能够删除特定的激酶或磷酸酶基因，并研究随后设计出的克隆。“通过CRISPR克隆中的磷酸化蛋白质组可以得出结论——关于特定基因产物在特定信号通路中的作用。”Knepper表示。
好抗体的力量
从好的一面来讲，抗体对于分子标签、鉴定以及亲和纯化来说都是不可或缺的。但是抗体也存在缺点。“它们的量就是不够。”Carr说，“大多数都无法在所有的背景下起作用，也有一些根本不起作用。因此依靠抗体是非常具有挑战性的。”就质谱来说，近期抗体技术的提升已经助力了细胞信号和蛋白质组的研究。然而根据Carr的意思，“质谱在阐明抗体的脱靶效应上，发挥着主要的作用”。并不是所有被创造出来的抗体都是平等的，它们中有的在某些实验中表现良好，例如免疫印迹或免疫组化，但是在其他实验中的表现却不好，例如免疫沉淀。
针对靶标经过转录后修饰的抗体技术已经取得了突破性进展，主要是通过细胞信号技术（CST）公司的“基序抗体”实现的。“CST公司开发了一类抗体，它的设计主要针对与位点特异性PTM表位完全不同的特定的PTM序列基序。”CST公司 KinomeView与 PTMScan 蛋白质组服务项目经理Jeffrey Silva表示。案例包括磷酸化丝氨酸/苏氨酸和磷酸化酪氨酸的靶标。尽管CST公司并没有为糖基化专门设计基序受体，但他们的确正在开发针对乙酰基赖氨酸、甲基精氨酸、甲基赖氨酸、琥珀酰赖氨酸和磷酸化组胺的抗体。
Silva解释，CST公司通过整合公司的基序抗体，研发了PTMScan Direct的试剂，能够应对客户针对六大不同信号领域的工具需求。这六大领域包括：酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞凋亡、细胞周期和DNA损伤、AKT和PI3激酶信号，和一种能够鉴定大约19种主要信号通路的多通路试剂。这使得研究者能够通过一次多重液质联用分析，就能从许多重要的信号通路中找到关键的节点。“这是一种有效的方式，去寻找那些受到刺激影响的关键通路，随后他们可以快速聚焦在受到影响调控的蛋白上。”Silva表示。总之，多通路试剂可以让研究者鉴定并量化409种蛋白和1006种独特的磷酸多肽。CST公司也为泛素化、乙酰化和切割的半胱天冬酶底物研发了新的PTM抗体。
G蛋白偶联受体（GPCRs）的抗体对于多个信号通路都十分重要，而且需求性很高，但是一直以来它们都很难生成。最大的挑战在于“找到亲和力足够高的抗体，来区分近缘的受体和受体亚型。”Enzo生命科学公司的产品经理Lora Tebbetts表示，他们公司提供超过120种G蛋白偶联受体和相关蛋白的抗体。Tebbetts说，更多的特异性抗体是使用“来源于（G蛋白偶联受体的）N端或C端序列多变区域的多肽，或者是结合了作为免疫原的载体蛋白的第三细胞内环。”
微芯片解码信号网络
对于细胞信号研究而言，使用微芯片的优势之一在于这仅需要少量的试剂及样品。LC Sciences公司的新型磷肽微阵列是设计在一个微芯片上，用于一次性评估不同通路中关键信号蛋白在表达水平上的变化。它可以“通过检测包含相应磷蛋白结合结构域的蛋白表达水平，来绘制酪氨酸磷酸化蛋白质组相互作用的网络”，Hebel表示。这一点很独特，因为研究人员可以一目了然地了解实验操作如何影响信号通路。
Hebel说，在定制的微阵列上使用磷酸结合结构域而非更传统的抗体结合有着多方面的原因。“探针密度更高，也就意味着更高的特异性。”他解释道，并且该技术并不需要依赖“高亲和性的抗体，或是需要具有不同亲和性的很多不同抗体以及优化的结合条件——这会要求当任何设计改变时，都需要复杂的重建及验证。”
磷酸化蛋白也是加州理工学院纳米系统生物癌症中心的主任、化学教授James Heath的研究主题。Heath利用单细胞蛋白质组学来研究磷酸化蛋白信号级联通路，使用脑部肿瘤的成胶质细胞瘤细胞作为模式系统。这些肿瘤像许多其他类型的癌症一样，并不仅由一种癌细胞组成，而是异质性群体。人们认为这种异质性解释了为什么靶向一种信号蛋白的单一癌症药物常常会失败。Heath通过研究成胶质细胞瘤细胞的信号级联通路，来了解如何将多种癌症药物组合起来以实现有效治疗。
Heath的研究组使用自制的微流控芯片来研究个体细胞，将其装置在微芯片内各自的小室里。每个细胞都分别经过溶解，这样它的组分就能够被每个小室内的抗体阵列所捕获。团队随后使用经过校准的定量抗原捕获ELISAs，测量每个细胞中蛋白的拷贝数目。该阵列包括针对已知参与成胶质细胞瘤信号通路蛋白的抗体，例如磷酸化AKT、磷酸化ERK、磷酸化SRC和磷酸化EGFR。Heath使用“靶向药物去击中这些维持肿瘤并助其生长的信号通路，就像那些由EGFR所驱动的一样”，他说。
用癌症药物来治疗肿瘤可能会使之停止生长，甚至会让它缩小。但是在成胶质细胞瘤的所有案例中，Heath说，肿瘤很快就会发展出抗药性，并且开始飞速生长。然而对一些肿瘤来说，这并不是达尔文选择的结果；Heath发现这些耐受的细胞并不是单纯的幸存者，它们是适应者。
“对药物产生反应的细胞，同样也产生了对药物的抗性。”Heath说，通过激活特定的信号通路——这种相互作用与Heath在分析药物治疗前后的单细胞时所观察到的是一样的。“如果能够鉴定出被药物激活的其他通路，这就会大体上告诉你哪些疗法的组合可以用来治疗抗性。”Heath说。换言之，如果能找到第二种药物来阻止适应性反应，那么你就能够杀死这些肿瘤。
Heath的结论为癌症治疗带来了希望。例如，如果他使用ERK抑制剂或者EGFR抑制剂来治疗肿瘤，结果并不会给人留下深刻印象。但是，如果他使用两种能一起防止耐药性的抑制剂来治疗肿瘤，他表示肿瘤将“完全停工”。
从单细胞到组织
研究单细胞对于更好地理解组织来说也有很大价值，因为组织是细胞的群落，斯坦福大学微生物和免疫学系教授Garry Nolan说，他也是NHLBI系统免疫学蛋白质组研究中心的主任。“它们互相影响，并且生活在共同的环境当中。”他说。“它们的个体生物学其实是在研究我们为何是正常的或出现功能失调。”他将癌症视为一个组织，这个组织选择开始自己的生活，并且创造出自己的背景或环境。“如果我们希望能够理解（环境的）复杂性，以及药物如何对它起作用，那么我们需要理解这些群落参与者是如何相互作用的。” Nolan说，“这意味着你需要尽可能地去分析你认为相关的事情，自己又不能淹没在信息里。”
Nolan开创了一种质谱流式细胞技术，可以同时检测在单细胞中表达的足量蛋白成分。他使用抗体针对标记了同位素质量标签（不是荧光标签等）的多种目标蛋白，可以进行多重分析，规模比显微镜检查更大，因为光谱叠加并不是问题。当个体细胞进入质谱流式细胞仪中时，它会蒸发，同时同位素标签会被质谱仪读取。Nolan的实验室通过使用该系统，能够使用35~40种标签来生成信号通路的快照。如今，他们能检测大约50种参数。
Nolan的实验室使用了Fluidigm公司的CyTOF 2质谱流式细胞仪。CyTOF 2近期的改进使之更易于“通过做实验帮助更好地理解不同细胞类型中蛋白的信号特性”，Fluidigm 公司的首席科学家Olga Ornatsky表示。Fluidigm 公司正在采用CyTOF 2系统来进行使用免疫组化类型染色的固定组织部分的成像技术。传统的免疫组化分析通常一次能够检测三到四种荧光标记，CyTOF的版本能一次检测30多种标记。“这将拓宽我们所能提出的问题的范围。” Ornatsky表示。
蛋白质组研究者越来越多地使用这些技术，研究也不只是局限在蛋白水平的改变。现在，他们可以观察信号分子和网络的复杂相互作用。PTMs如何调控和改变这些通路，为这项研究带来了额外的一层谜题，科学家不得不提出问题：“这些修饰会如何相互影响？” Carr表示。同时，随着更加强大的蛋白质组工具日渐增多，例如更好的抗体和质谱技术，研究人员将能够更加深入地挖掘这些问题。■
（译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员）
Caitlin Smith 是俄勒冈州波特兰市的自由科学撰稿人。
DOI: 10.1126/science.opms.p1500093
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2015 年4 月17 日
《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/site/products/lst_20150417.xhtml。